实验动物中心小鼠基因型鉴定标准操作规程

实验动物中心小鼠基因型鉴定标准操作规程

简介：

对小鼠进行基因型鉴定是实验动物中心表型分析平台提供的常规服务，在动物实验研究中也是不可或缺的一环，但作为一项基础性工作，同学们在实际操作中常常遇到问题，为了帮助实验人员更标准的进行小鼠的基因型鉴定，同时为在基因型鉴定过程中遇到问题的同学提供参照，中心制定了小鼠基因型鉴定操作规程。

实验原理：

使用聚合酶链式反应（polymerase

chain reaction, PCR）对基因工程小鼠的基因型鉴定的基本原理是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳对比不同基因型特异产物的大小（一般差异在100bp以上），根据电泳条带差异来直接区分小鼠的不同基因型。

操作规程：

1.

剪鼠尾：

小鼠出生后9-14天编号并剪鼠尾，鼠尾要求长度大约0.2-0.5cm，鼠尾可存放至-20°C冰箱保存备用。

2.

提取DNA模板：

2.1

试剂

1)

鼠尾裂解液

1M Tris HCL (PH=8.0)

10 ml

0.5M EDTA

4 ml

1M NaCL

400ml

10% SDS

100ml

Add MilliQ to 1000 ml

2)

蛋白酶K溶液

蛋白酶K（简称PK, 20mg/ml

in MilliQ)，stored @-20℃

3)

TE Buffer

1M Tris Hcl（PH=8.0）

5ml

0.5 M EDTA(PH=8.0)

1ml

Add MilliQ to 500ml

2.2

实验流程

1)

每个样品加入300ul裂解液+5ul PK（20mg/ml），55°C消化过夜（不少于4h）。

2)

乙醇沉淀：加入600ul（双倍体积）-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒，直到可以清楚的看见絮状沉淀。

3)

离心12000rpm，5min。

4)

晾干：离心后，倒出上层液体。倒放在一张平板纸上（注意一定要立着，这样里面的液体采用较快的流到EP管口）。差不多5-10min左右，把立着的管子换一个位置，轻轻向下按一下（目的是用平板纸吸去聚集在管口的液体，做了这步可以节省很多晾干时间）。等待30-60min至完全晾干，此时沉淀变透明，提取的DNA质量佳。

5)

加入200ul MilliQ水或TE溶液，使用上下振摇的方式充分溶解DNA。

6)

取3ul gDNA模板，在25ul的反应体系中进行PCR。

3.

PCR：

3.1

反应体系（25ul体系）

2*MIX

12.5ul

Primer 1

0.5ul

Primer 2

0.5ul

gDNA template

3ul

水

8.5ul

3.2

反应条件（touchdown）

Step #

Temp °C

Time

Note

1

95

4 min

-

2

95

15sec

-

3

65

30sec

- 1 °C

4

72

30sec

-

5

Go to Step 2-4,

10 times

6

95

15sec

-

7

55

30sec

-

8

72

30sec

-

9

Go to Step 6-8,

25 times

10

72

5min

-

11

4

hold

-

4.

电泳

4.1

配置凝胶：根据目标条带配置1-3%的琼脂糖凝胶，将1g-3g琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液，微波炉加热至琼脂糖融化，加入10ul核酸染料（EB替代物），倒入电泳模板中，并插入梳子，待冷凝后使用。

4.2

加样：向琼脂糖凝胶中加入适量的DNA，小孔建议加10ul，大孔建议加20ul，并根据目标条带大小选择合适DNA marker加入凝胶中。

4.3

跑胶：电泳仪设置120V电压，跑20-30min。

4.4

成像：使用凝胶成像系统观察、拍摄照片。

4.5

编辑胶图，出基因型鉴定结果报告。

此规程版权和解释权归清华大学实验动物中心所有

制订人：刘苗苗、陆玉娜、常在

清华大学实验动物中心

2022年7月22日