别让样本毁在第二步！进行空间转录组切片包埋实验你可能需要知道这些！

图二：OCT包埋示意图

Q2

OCT包埋剂对RNA的影响？

根据过往项目经验发现，过量的OCT包埋剂主要影响后续RNA完整性评估的RIN值准确性。因此为了获取准确的RIN值，对于OCT过量的包埋块（1mm以上），建议在切片前用刀片修剪多余的OCT，或者切片后用镊子去除多余的OCT。此外还需要注意在OCT固定前要防止冷凝水的出现，一旦出现可能导致后续组织染色时出现组织降解。

图三：正常染色和组织降解对比

Q3

与冷冻包埋方案相比，石蜡包埋方案有什么特点？

第一点是研究针对性不同，石蜡包埋的样本可以保存较长时间，可以在后续对样本进行回顾性研究（比如HE染色、免疫组化）。而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成而破坏组织细胞形态的结构，造成抗原的弥散，定位不够准确。

第二点是可以弥补部分组织冷冻包埋效果不佳的弊端。如透化效果不佳或组织溶解性强就可以采用石蜡包埋。同时，石蜡切片可以切出较薄切片，适合高分辨率病例分析，原位杂交探针容易渗透到组织中去，得到数据颜色和形态都会较冰冻切片好，适合高分辨率病例分析。

Q4

组织含水量高的样本如何处理

样本在包埋降温的过程中，样本内的水分会形成冰晶从而刺破细胞。冰晶在-60℃~0℃形成，因此含水量较低或正常的样本，我们采用快速降温的方式快速度过冰晶形成温度带，使样本中的自由水尽可能地形成玻璃态的均匀团块而非冰晶。玻璃化不会出现原生质脱水，因此也不会损害细胞的结构。

而含水量较高的样本则因为自由水的含量高，更容易形成冰晶，需要先进行脱水处理，使用30%蔗糖在常温下进行1小时脱水，组织形态不会发生改变，对RNA降解的影响也较小。

Q5

冷冻包埋方法如何选择？

目前主流有两种冷冻包埋的方法——先冷冻再包埋和冷冻同时包埋。

两种方法各有优劣，第一种方法可以快速降温，让组织快速度过冰晶期，保护细胞完整性，并且先速冻能减少OCT接触带来的渗透压力，但是在包埋时接触相对高温的OCT可能造成组织边缘的细胞溶解，此外冷冻后包埋可能导致组织与OCT结合不紧密，导致切片易碎裂；第二种方法组织不会形成二次冻融，切面的整体完整性更佳，但是，操作过程略复杂，在手术台或外出采样的情况下不易操作。

目前项目经验看下来，第一种先冷冻再包埋法适用于需长期保存原始组织（如珍贵样本），或需分批次包埋的实验设计。第二种同时包埋法适合更多的组织类型，可以得到较好的切片结果。不过还是要根据组织类型来进行选择。如穿刺样本等一些较小、较轻的样本则一般推荐使用液氮+异戊烷的方法进行冷冻包埋。

不同组织类型的适应性也存在一定差异，因此最好还是做一下预实验，再根据预实验结果进行选择。

Q6

如何防止切片在冷冻切片过程中冻干

如果将组织切片放在Visium芯片上并长时间暴露在低温恒温器环境中，会发生冻干，而冻干会影响组织形态和数据质量。

图四：冻干区域（蓝框内）

为了防止组织在切片过程中冻干，可以将Visium芯片预冷，并在将切片放在Visium芯片前将其密封在低温恒温器中。根据以往项目经验，不建议将多个组织切片分不同天放置在同一张Visium芯片上，这样做可能会引起温度波动导致组织损伤。

Q7

空间转录组是否和免疫组化（IHC）兼容

目前10X的Visium是支持在相同切片上同时进行IHC和Visium的。要实现同一组织切片的两种组学研究需要保证免疫荧光染色在前，空间转录组分析在后。染色后需快速成像并进入Visium流程，避免RNA降解。返回搜狐，查看更多